郭帆、王平团队揭示人卵细胞表观遗传动态概观

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近日，中科院动物所郭帆研究员与四川大学王平教授团队在Cell Press旗下期刊Cell Stem Cell上在线发表了题为“ in Human Using -cell Multi-omics ”的研究论文，该研究通过利用单细胞多组学测序技术，首次揭示了人卵细胞DNA甲基化的建立过程和分子调控特征。

Cell Press细胞出版社微信公众号对该论文进行了解读，旨在与广大科研人员深入分享该研究成果以及一些未来的展望。

相比于精子和体细胞，哺乳动物成熟卵细胞的DNA甲基化谱是非常独特的。在小鼠和人类早期胚胎发育过程中，生殖细胞的前体细胞——原始生殖细胞会经历大规模的DNA甲基化擦除。在雌性小鼠中，原始生殖细胞随后经历特化形成卵原细胞，但仍会维持低水平的DNA甲基化，直到出生后在卵泡发生过程中才重新建立起卵细胞特异的DNA甲基化谱。以往的研究以小鼠为模型，报道了卵细胞发生过程中DNA甲基化建立的概观及机理。然而，对于人卵细胞重新建立DNA甲基化的过程及其调控因素仍知之甚少。主要原因在于，人卵细胞数目极其稀少澎湃新闻 医学，传统的基于大量细胞的DNA甲基化分析方法无法适用于数量稀有的人卵细胞样品；另外，在人卵中进行类似于小鼠卵的功能实验——例如基因敲除或生化分析，几乎也是难以实现的。所以，要研究人卵细胞DNA甲基化的建立并鉴定影响这一过程的关键因素就需要开发出新的工具和分析方法。

研究人员通过建立起的单细胞多组学测序方法——-seq（-cell , RNA , and DNA ），首先对多个阶段的人卵细胞和卵巢体细胞进行了转录组、DNA甲基化组和染色质可及性的分析。研究人员发现人卵细胞在生长过程中伴随着广泛的起始性DNA甲基化的发生，并且基因转录和染色质可及性与DNA甲基化的重新建立紧密相关。此外，研究人员还发现一些转录因子，例如CTCF和SP1，可能通过参与调节染色质可及性来影响人卵细胞中特定位点的DNA甲基化建立。通过在单细胞与多组学层面上对人和小鼠不同时期的卵细胞进行系统性的比较，研究人员进一步发现了人卵特异的DNA甲基化修饰基因位点以及其可能的发生机理。

虽然基因组内的大量重复元件在成熟的人卵中具有较高的DNA甲基化水平，但研究人员发现依然有少量的ALU元件会逃离DNA甲基化并且在卵细胞生长阶段高度开放；有趣的是，这一类ALU元件往往存在于重要功能基因的附近，并且其关联基因在人与小鼠间并不保守。最后澎湃新闻 医学，研究人员探索了组蛋白修饰及其修饰酶在人卵DNA甲基化建立中的作用；虽然人与小鼠卵细胞相比，相关组蛋白修饰酶在RNA和蛋白表达上存在一定的差异，但组蛋白H3K4甲基化修饰在拮抗DNA甲基化建立中仍具有重要作用；此外，组蛋白H3K36甲基化修饰很可能也参与人卵DNA甲基化的建立。该研究深入分析了人卵细胞DNA甲基化的从头建立过程和分子调控特征，对于理解人类生殖细胞的表观遗传编程及其相关机理具有重要意义。

作者专访

Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者郭帆研究员

代表研究团队进行了专访，请他为大家进一步详细解读。

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人类卵母细胞中的DNA从头甲基化有什么重要作用？这对胚胎发育有什么影响？

郭帆研究员：

哺乳动物的发育起始于单细胞的受精卵，母源和父源的染色体DNA各占受精卵基因组DNA的一半。虽然母源和父源的基因组DNA在序列上非常相似，但在功能上这两套基因组DNA却不能相互替换，关键原因是母源和父源的基因组携带有各自特异的DNA甲基化修饰。其中，来源于卵子和精子的印迹控制区域（ ，gICRs）在胚胎发育过程中起重要调控作用。已有的研究表明，绝大部分的gICRs甲基化位点来源于成熟的卵细胞，其DNA甲基化修饰会在受精后被保留下来，只在胚胎期的原始生殖细胞中再被擦除。过去利用基因敲除小鼠模型，人们发现当卵细胞缺失DNA甲基转移酶或辅因子、组蛋白去甲基化酶Kdm1b时，均会影响母源gICRs位点DNA甲基化的正常建立；虽然这些DNA甲基化异常的卵细胞可以正常成熟和受精，但会发生胚胎期致死。人类中的一些胚胎源性疾病，也被报道与母源印迹位点DNA甲基化的异常相关。因此，人卵细胞DNA甲基化的正确建立对于胚胎发育是非常重要的。

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要研究人类卵母细胞DNA甲基化的建立会遇到哪些困难？本研究如何应对这些挑战？

郭帆研究员：

一是之前所有关于哺乳动物卵母细胞DNA甲基化的研究均来自小鼠模型，而人类生殖细胞的发育时程与小鼠存在显著差异，所以并不能百分百确定DNA甲基化的从头建立发生在人卵母细胞生长过程中。这就需要有较强的探索精神，还要提前评估课题失败的风险并做好心理准备。

二是即使获得了不同时期的卵母细胞，用什么方法来精准检测和分析DNA甲基化的概观？以往用于测定大量混合细胞DNA甲基化的技术显然是难以行通的。这就需要在开展正式实验前建立用于少量细胞或单细胞DNA甲基化检测的新方法，同时要保证新方法的稳定性、精准性和高效性。

三是如果仅仅只是检测DNA甲基化，依然难以获得人卵细胞DNA甲基化从头建立的机制线索。而人卵细胞自身属性导致传统常规的功能研究方案难以奏效，因此需要建立一套全新的分析方案来进行机制探索。

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为什么最终选择了单细胞多组学测序方法进行研究？

郭帆研究员：

单细胞多组学测序技术是近年发展起来的一系列相关方法的统称，并被选为 期刊2019年的年度方法学。单细胞多组学测序技术既能克服细胞数目少的限制，同时也能多层次、多角度地描绘细胞间的差异，可以系统地反映单个细胞中各层组学之间的直接和潜在联系。我在2014年开始对单细胞多组学感兴趣并尝试建立新方法，较早进入这个领域，在2017年率先发表了可以同时测定DNA甲基化和染色质可及性的单细胞多组学测序方法——-seq。在我成立课题组后，2018年底我们实验室发表了改进版本的-seq2，对小鼠卵母细胞进行了单细胞多组学解析。与此同时，我们也建立了具有中等细胞通量、可以同时检测单细胞转录组、DNA甲基化组和染色质可及性的-seq，用于研究人卵细胞DNA甲基化的建立。因为本身具有一定的技术积累，并且很早就为研究相关问题做准备，所以我们选用单细胞多组学测序并开发出了适用于该课题的方法。

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本研究获得了高精度的人卵细胞多组学数据，实现了很高的基因组覆盖率，这对后续研究有何帮助？

郭帆研究员：

一是帮助后续研究进一步开展人卵细胞DNA甲基化建立机制的探索；二是为相关疾病的研究提供可以比对的人卵细胞多分子维度图谱；三是为今后体外培养人工配子提供体内发育的人卵细胞基因表达和表观遗传蓝图。

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生长期卵母细胞和成熟卵母细胞在DNA甲基化相关基因的表达方面有何差异？

郭帆研究员：

目前已知的哺乳动物DNA甲基转移酶主要有DNMT1、和，DNA甲基双加氧酶有TET1、TET2和TET3。其中，DNMT1和在生长期卵母细胞和成熟卵母细胞均表达；人卵细胞中主要高表达TET3。

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本研究发现，在卵母细胞DNA甲基化建立过程中，染色质可及性与DNA甲基化水平密切相关，这说明了什么？

郭帆研究员：

一是说明人卵DNA甲基化在建立过程中，需要有开放的染色质环境，利于DNA甲基转移酶与修饰区域的结合。二是说明影响染色质可及性的其它表观遗传修饰——例如组蛋白修饰，也会在该过程中起重要作用。三是说明调节染色质可及性的反式作用因子——例如转录因子，也会影响人卵DNA甲基化的建立。

作者简介

郭帆

研究员

郭帆，中国科学院动物研究所、中国科学院干细胞与再生医学创新研究院研究员。主要研究哺乳动物早期胚胎发育与生殖细胞发生过程中的表观遗传调控，发展和建立了用于高精度检测基因组中DNA甲基化修饰、染色质状态与基因表达的单细胞多组学测序方法，揭示了影响哺乳动物DNA甲基化编程与重编程的多个关键因素，以通讯作者在、Cell Stem Cell、Cell 、 等期刊发表研究论文，获得国家自然科学基金委优秀青年科学基金资助。

王平

教授

王平，四川大学华西第二医院教授、主任医师，妇科主任。从事临床工作三十余年，专攻各种妇科疑难重症，擅长多种卵巢疾病、妇科恶性肿瘤及盆底疾病的诊治。中华医学会妇产科分会盆底学组委员、中国医师协会妇产科专委会生殖道畸形学组委员、中国老年医学会妇科专委会常委、四川省国际医学交流促进会妇科专委会主任委员、四川省妇产科质控中心副主任、四川省医学会妇产科专委会副主任委员、四川省医师协会妇科专委会常委、四川省预防医学会妇科肿瘤专委会副主任委员、四川省预防医学会妇科盆底疾病专委会副主任委员；《实用妇产科杂志》常务编委、《中华临床妇幼杂志》编委。获中华医学科技奖两项、四川科技进步奖两项。

相关论文信息

研究成果发表在Cell Press旗下Cell Stem Cell期刊上，点击“阅读全文”或扫描下方二维码查看论文。

▌论文标题：

in human using -cell multi-omics

▌论文网址：

(21)00169-7#%20

▌DOI：