Nat. Commun：一种高灵敏性的去甲肾上腺素荧光探针用于大脑研究

今天分享一篇2023年发表在 Nat. . 上的文章。该文的第一位通讯作者是华东师范大学的张琪伟研究员，张琪伟研究员的主要研究领域有超分子化学、有机光电功能材料和化学生物传感器。该文的第二位通讯作者是华东师范大学的田阳教授，田阳教授的主要研究领域为活体脑电信号的化学表达分析研究、脑神经化学分子的精准分析测量和长时程稳定的脑成像方法的建立等。

去甲肾上腺素（NE）是一种儿茶酚胺神经递质，广泛投射在整个大脑和脊髓。它主要负责对注意力、觉醒、学习、记忆、压力、心率和血压等进行精确调节，并与几种精神和神经退行性疾病密切相关，如阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症和注意力缺陷等，因此，开发具有高灵敏度和高时空分辨率特点的NE检测工具对于理解其在生理病理过程中发挥的具体作用具有重要意义。

考虑到去甲肾上腺素从突触前释放会通过细胞膜，作者设计合成了一例具有细胞膜靶向的双光子去甲肾上腺素荧光探针BPS3，其中，由碳链连接的两个苯基吡啶作为探针支架，一端修饰溴原子，另一端连接有甲苯硫代碳酸酯作为NE的识别基团，探针在响应NE后导致其绿色荧光消失。有趣的是，作者在随后的实验中发现BPS3能够在100 ms尺度上快速响应NE，随后作者详细探究了反应加速的机制去甲肾上腺素反转作用，发现探针中间存在的碳链能够使探针以不同的构象存在，经过实验表征和理论计算，作者发现PBS3更倾向于以折叠构象存在，并且此时识别位点的碳原子表现出更强的亲电性，从而提高了与NE的反应活性。此外，作者还发现BPS3与NE的反应速度还受到溶剂的影响，即二者在水溶液中有很快的反应速度，而在有机相中的反应速度大幅降低，理论计算表明，水的参与降低中间过渡态的能量，从而提高了反应速度。最后，探针成功用于神经细胞和组织中NE的快速成像并发现了AD细胞中NE水平降低和氧化应激在其中发挥的作用。这种快速响应的NE荧光探针为监测NE的瞬时释放和理解NE在生理病理过程中发挥的具体作用提供了强有力的分析工具。

图 1 BPS3以折叠构象存在并在水的参与下能够在100 ms尺度上响应NE。

具体来说，作者首先合成了荧光探针BPS3，随后研究了探针检测NE的能力，如图所示，探针响应NE后荧光强度降低（图2a），并且能够在0-200 nM内定量检测NE（图2b），此外，探针表现出良好的选择性（图2c，d）。这些结果表明探针能够灵敏、定量和选择性的检测NE。接着，作者利用高分辨质谱和高效液相色谱探究了探针响应NE的机理，如图所示（图2e，f），探针响应后的分子结构能够在质谱图找到对应峰，探针响应NE前后的结构与脱落的基团都成功利用高效液相色谱进行了表征。由此推测，探针响应NE的机制如先前报道的NE荧光探针一致，即通过级联亲核取代反应实现（图2g）。

图 2 BPS3响应NE的光谱、选择性实验和反应机理分析。（a）BPS3加入NE后的荧光光谱。（b）荧光变化速率与NE浓度的曲线图和线性拟合。（c）探针BPS3对NE的其他神经元递质和氨基酸的选择性。（d）探针BPS3对NE与其他神经元递质和氨基酸的竞争试验。（e）NE、BPS3、BPS3-OH的HPLC谱。（f）BPS3产物与NE在水溶液中反应的HRMS谱。（g）探针BPS3与NE反应的顺序亲核取代环化机理。

由于作者发现BPS3能够快速响应NE，于是作者对探针响应NE的具体时间进行了表征，结果表明，5 μM的BPS3与100 nM的NE能够在100 ms内完成反应（图3a），这一有趣的发现激励作者去探究其背后的加速机制。受到作者以往工作的启发，作者首先考虑了探针构象对反应速度的影响，理算计算表明BPS3更倾向于以折叠构象存在（图3c，d），接着，作者利用NOESY对其折叠构象进行表征（图3b），此外，作者通过计算比较了探针两种构象下识别受体反应位点碳原子的电荷值，发现折叠构象中的电荷值高于拉伸构象的电荷值（图3d），这说明探针的折叠构象会提高反应位点碳原子的亲电性，从而提高探针与NE的反应速度。为了进一步验证这一假设，作者合成了仅碳链长度不同的BPS2和BPS4，其中，由于BPS2的碳链较短使其更容易以拉伸状态存在，而BPS4则与BPS3相似的倾向于以折叠构象存在，反应结果表明，BPS2与NE的反应速度大幅降低，而BPS4则与BPS3保持了对NE的快速响应。为了更加直观的验证探针构象对反应动力学的影响，作者构建了一个超分子通道，该通道为大环葫芦脲-7，碳链连接的两个吡啶由于和超分子通道的高亲和性而进入其中，探针的识别受体暴露在外面（图3v），作者发现，当使用这种方式使探针保持拉伸结构的时候，探针与NE的反应速度大幅降低，而当向反应体系中加入与超分子通道亲和性更强的1-羟基-金刚烷将探针置换下来后，探针与NE的反应速度恢复。这些丰富的证据证明了探针的折叠构象能够加速探针与NE的反应。

图 3 分子构象表征、调控及对反应动力学的影响。（a）BPS2、BPS3、BPS4和BPS3 + CB[7]）水溶液的归一化荧光响应动力学。添加100 nM NE。(b）BPS3部分2D NOESY NMR谱。（c，d）分别计算BPS3碳硫碳折叠和拉伸构象的电荷。（i - v）BPS2、BPS3、BPS4构象和通过超分子方法进行的分子构象调控示意图。

作者发现相比于在测试时使用有机溶剂，水作为溶剂能够大幅提高探针与NE的反应速度，于是，作者对反应过渡态的能量进行了计算，发现水的参与会通过形成中间六元环而降低反应活化能，从而加快反应速度（图4）。

图 4 探针在水存在下的反应机理及过渡态能量计算。（a）BPS3溶液在不同溶剂中的归一化荧光响应动力学。（b）拉伸探针BPS3和NE之间反应的反应途径和可能的过渡状态，无论有无水的参与。（c）计算了探针BPS3和NE在不同途径中的反应过程中化合物的相对能量和可能的过渡态。

最后，作者将探针用于成像细胞和组织切片中的NE。作者发现，探针能够快速响应高钾刺激下的NE释放（图5b，c），并发现阿尔兹海默症模型生物脑切片中的NE水平出现了降低（图5e），且能够通过清除氧化剂得到一定程度的恢复（图5f去甲肾上腺素反转作用，g）。

图 5 BPS3成像细胞和组织切片中的NE。（a）BPS3和商业膜探针的共聚焦荧光图像。（b）分别用PBS缓冲液或高浓度钾刺激bps3孵育的神经元的延时共聚焦荧光图像。（c）分别受PBS（磷酸盐缓冲盐水）或高浓度钾刺激神经元的荧光变化率过程。（d）在高浓度钾刺激下NE释放的可能过程的说明。（e）用BPS3探针标记的小鼠大脑海马区三维双光子共聚焦荧光图像。（f）正常和阿尔茨海默氏病（AD）小鼠大脑的双光子荧光图像。（g）直方图。

综上所述，作者开发了一种能够非常快速和灵敏的NE荧光探针BPS3，并发现其极快的检测速度得益于分子的折叠构象导致的反应位点碳原子亲电性增强和环化过程中水分子的参与，揭示了一种双重加速机制。最后，探针成功用于神经细胞和组织中NE的快速成像并发现了AD细胞中NE水平降低和氧化应激在其中发挥的作用。